RayBiotech：人体炎症阵列Q3

解析文章：《Protein Array-Based Detection of Proteins in Kidney Tissues from Patients with Membranous Nephropathy》

链接：https://doi.org/10.1155/2017/7843584

背景

膜性肾病（Membranous Nephropathy, MN）是一种自身免疫性炎症疾病，主要表现为肾小球基底膜（Glomerular Basement Membrane, GBM）增厚，是成年人肾病综合征的主要原因之一，占终末期肾病（End Stage Renal Disease, ESRD）病例的20%至40%。MN的病理特征是GBM下免疫复合物IgG和C3的沉积导致GBM增厚。尽管已知自身抗体和补体在MN的发展和进展中起重要作用，但涉及GBM增厚的具体途径仍不清楚。蛋白质作为细胞功能的执行者，可能参与了MN的整个发病过程。然而，大规模筛选肾脏蛋白质并进行功能分析的研究仍较为罕见。蛋白质微阵列技术因其能够高通量筛选数千种蛋白质而成为一种先进的蛋白质研究技术，相比质谱和其他传统方法（如蛋白质印迹和酶联免疫吸附试验）具有更高的效率和更小的样本需求。

方法

样本收集

本研究获得了中国人民解放军总医院伦理委员会的批准，并遵循《赫尔辛基宣言》及其后续修正案或可比的伦理标准。所有样本均来自中国人民解放军总医院肾病科。研究共纳入了15个肾脏样本，其中6个来自特发性MN患者，9个来自肾细胞癌（Renal Cell Carcinoma, RCC）患者的正常肾脏组织作为对照。MN患者均通过肾活检病理明确诊断为特发性MN，并排除了自身免疫性疾病、感染、糖尿病和高血压等其他疾病。

蛋白质提取

新鲜样本收集后，立即用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤以去除杂质和血液。通过离心去除上清液，重复此过程直至组织几乎无色。然后按照制造商的说明将组织解离并裂解。裂解液离心后，使用BCA法测定上清液中的蛋白质浓度，并将样品稀释至所需浓度。

蛋白质微阵列检测

本研究选择了三种蛋白质芯片来比较它们在检测肾脏组织中蛋白质水平的性能：定量蛋白质芯片Quantibody 5 Human Inflammation Array 3（QAH-INF-3）和两种半定量L系列抗体芯片L-507和L-493。QAH-INF-3是一种基于多重夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）的定量阵列平台，能够准确同时检测40种蛋白质的浓度。L-507和L-493分别基于生物素标记和激光荧光扫描技术，可分别检测507和493种蛋白质。对于检测，单个组织样本分别使用12.5μg和6.25μg的样品进行QAH-INF-3检测，使用50μg和25μg的样品进行L-507和L-493检测。蛋白质杂交按照各自制造商的说明进行，荧光图像使用Axon GenePix扫描，数据使用GenePix Pro 6.0软件进行分析。

验证实验

为了验证结果，选择了EpCAM-1、CTSD和ADAMTS-4作为确认标记，并使用ELISA试剂盒测量MN和正常对照的组织裂解物。此外，还进行了免疫组织化学验证，以避免组织裂解物中跨膜蛋白质的假过表达。

统计分析

使用Student's t检验处理定量数据，差异表达的蛋白质（Differentially Expressed Proteins, DEPs）定义为MN/N比值大于1.4且P值小于0.05的蛋白质。使用DAVID v6.8 Beta进行基因本体论（Gene Ontology, GO）分析，使用STRING v10进行蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）分析。

实验

RayBiotech品牌人体炎症阵列Q3（货号：QAH-INF-3）的作用和价值

在本研究中，RayBiotech品牌的人体炎症阵列Q3被用作定量蛋白质芯片之一，以评估其在检测肾脏组织中蛋白质水平的性能。人体炎症阵列Q3是一种基于多重夹心ELISA的定量阵列平台，具有以下特点和价值：

高通量检测：人体炎症阵列Q3能够同时检测40种不同的蛋白质，相比传统方法如单个ELISA或蛋白质印迹，大大提高了检测效率。这对于需要同时分析多种蛋白质的研究尤其有价值，如本研究中对MN相关蛋白质的筛选。

准确性：通过构建标准曲线，人体炎症阵列Q3能够准确测量蛋白质的浓度。这对于定量研究至关重要，有助于确定蛋白质在疾病状态下的表达变化。

易用性：人体炎症阵列Q3的使用相对简单，按照制造商的说明进行操作即可。这降低了技术难度，使得更多研究人员能够轻松使用该平台进行研究。

重复性：尽管在本研究中人体炎症阵列Q3未被选为最适合检测肾脏组织蛋白质的芯片，但其良好的重复性是值得肯定的。这对于需要多次重复实验以确保结果可靠性的研究尤为重要。

然而，在本研究中，人体炎症阵列Q3在检测肾脏组织蛋白质方面的性能并未达到预期。荧光图像、标准曲线和散点图分析显示，只有22.5%的信号强度比值在1.3至2.0之间，远低于理论比值。这表明QAH-INF-3在检测肾脏组织蛋白质时可能受到某些因素的限制，如抗体质量、样本处理或芯片设计等。因此，尽管QAH-INF-3具有高通量、准确性和易用性等优点，但在特定应用中仍需考虑其适用性和局限性。

相比之下，L-493芯片在检测肾脏组织蛋白质方面表现出更好的性能。L-493能够检测更多可用的蛋白质（214种，占43.41%），且信号强度比值更接近理论值。因此，L-493被选为最适合检测肾脏组织蛋白质的芯片，并用于后续MN相关蛋白质的筛选和分析。

DEPs的筛选和分析

使用L-493芯片对MN患者和正常对照的肾脏组织进行了大规模蛋白质筛选。结果显示，L-493共鉴定出66种DEPs，这些蛋白质在MN中均上调。GO分析发现这些蛋白质涉及多个与MN发病相关的生物过程，包括细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）解体和组织、细胞粘附、细胞-细胞信号传导、细胞蛋白质代谢过程和免疫反应。

更重要的是，基于PPI分析构建了一个分子网络，揭示了这些蛋白质之间的相互作用关系。网络分析显示，多种蛋白质如EpCAM、FER、SYK、CDH1、KRT8、KRT19和KRT18与细胞粘附相关；激素如POMC、IAPP、PTHLH和ACE与细胞代谢相关；CXCL5、CCR7、CD55和CD46与免疫激活相关；TF、FN1、ADAMTS4、APCS、CTSD和MMP13与ECM重塑相关。这些蛋白质通过相互作用的蛋白质连接成一个完整的功能区。

验证实验

为了验证微阵列结果，选择了EpCAM、CTSD和ADAMTS-4作为确认标记，并使用ELISA和免疫组织化学进行了验证。ELISA结果显示，这些蛋白质在MN组织中的表达水平显著高于正常对照组织，与微阵列结果一致。免疫组织化学也显示CTSD和CD46在MN中过表达。这些验证实验进一步支持了微阵列结果的可靠性。

结论

本研究使用蛋白质微阵列技术筛选了MN患者肾脏组织中的差异表达蛋白质，并确定了多个可能与MN发病相关的途径。尽管QAH-INF-3芯片在本研究中未表现出最佳性能，但其高通量、准确性和易用性等特点仍使其在蛋白质研究中具有重要价值。未来研究可进一步探索这些差异表达蛋白质在MN发病中的具体作用机制，并考虑使用更大规模的样本和多种疾病组进行比较分析，以更全面地揭示MN的发病机理。