BPS Bioscience: PARP生物活性酶、蛋白质复合物、酶活分析试剂盒以及抑制剂筛选试剂盒

维持基因组完整性对于细胞的正常功能至关重要。在人体中，超过150种蛋白质构成了一个复杂的DNA损伤响应（DDR）网络，该网络不断扫描并修复DNA。多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）蛋白家族包含17个成员，它们催化蛋白质的ADP-核糖化。PARPs参与广泛的生物学功能，包括DNA损伤修复、基因组稳定性、染色质重塑、有丝分裂纺锤体组装、RNA周转和基因表达调控，以及DNA甲基化。尽管这些蛋白同属一个家族，但它们表现出不同的特征。一些PARPs仅具有单ADP-核糖化活性（MARylation），而另一些PARPs则催化多ADP-核糖化（PARylation），这种反应可以以线性或分支形式发生。

PARPs可能主要定位于细胞核、细胞质或两者兼有。它们在大小和结构上差异显著，并且包含多种功能域。值得注意的是，PARP5A和PARP5B除了催化域外，仅含有一个大的ankyrin结构域（因此被称为tankyrase，分别对应PARP5A的TNKS1和PARP5B的TNKS2）。其他显著特征包括PARP1、PARP2和PARP3对DNA的严格依赖性，以及每种酶对底物的特异性。

与许多具有关键作用的蛋白质家族一样，PARP蛋白在功能上存在重叠。PARP1和PARP2主要参与DNA修复，并且这两种蛋白都调控DNA损伤响应（DDR）网络。PARP2还调节表观遗传、增殖和炎症过程，并对精原细胞、胸腺和脂肪组织的发育至关重要。相比之下，当DNA损伤无法修复时，PARP1会改变转录并诱导细胞凋亡。PARP1是受损DNA的第一响应者，其重要性体现在其丰富的含量上，因为它是最常见的核蛋白之一。

DDR通路的缺陷会导致基因组不稳定和突变的积累，这些突变支持肿瘤细胞的出现和进化。因此，BRCA1或BRCA2（乳腺癌易感蛋白1/2）的突变会损害细胞通过同源重组（HR）修复双链DNA断裂的能力，从而增加个体患乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌的风险。然而，HR依赖性DNA修复系统的缺失意味着这些肿瘤细胞依赖其他修复通路来生存，这暴露了它们的治疗薄弱点。

事实上，对PARPs作为治疗靶点的兴趣最初源于发现PARP1/2抑制剂能够杀死携带BRCA1或BRCA2突变的癌细胞。这一观察首次证明了合成致死的概念，即同时破坏两种蛋白质会导致细胞死亡，而单独破坏其中一种则不会影响细胞活性。

目前，已有几种PARP抑制剂获得临床使用批准，还有许多其他抑制剂正在通过（临床前）临床阶段。随着研究证实阻断任何HR通路（不限于BRCA基因）都会赋予肿瘤细胞“BRCA样”特征，其应用范围也在不断扩大。改进现有的抑制剂、靶向其他PARP家族成员以及开发能够克服治疗耐药性的新抑制剂，仍然是癌症药物开发的重中之重。

BPS Bioscience专业生产生物活性酶、蛋白质复合物、酶活分析试剂盒以及抑制剂晒先试剂盒，可以提供多种PARPs蛋白和检测试剂盒：

1. PARPs蛋白：

2.1 PARPs活性检测，用于筛选抑制剂 

ADP-核糖化是一种可逆的反应，通过NAD?作为核糖供体，将ADP-核糖单元添加到蛋白质底物中存在的谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）或赖氨酸（Lys）残基的羧基上。在体外检测PARP活性时，需要使用PARP底物、NAD?、用于DNA依赖性PARP1-3的DNA探针以及纯化的PARP酶。所有这些组分都必须经过精心优化，以确保实验的灵敏度、稳健性和可重复性。

2.1.1 基于ELISA法检测

基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的化学发光和比色试剂盒旨在用于药物分析应用中检测PARP活性。在这些实验中，蛋白底物被包被在板上。接下来，在优化的实验缓冲液中加入生物素标记的NAD?混合物和纯化的PARP酶。然后加入链霉亲和素-HRP（辣根过氧化物酶），随后加入适当的HRP底物以产生化学发光或颜色变化。每一步骤后都会对板进行洗涤。信号强度与结合到组蛋白上的生物素-NAD?的量成正比。

2.1.2 基于AlphaLISA法检测 

AlphaLISA是一种由PerkinElmer开发的基于微珠的无洗涤技术，能够定量检测蛋白质-蛋白质结合或新的酶促产物。AlphaLISA PARP均相检测试剂盒利用了一种高度特异性的抗体，能够识别PARylated（聚腺苷二磷酸核糖基化）底物。因此，它们可以测量特定PARP家族成员的酶活性。检测的特异性与纯化蛋白的身份密切相关。检测流程非常简单：首先，将酶与生物素标记的底物进行孵育。接着，加入受体微珠和一抗，然后加入供体微珠。这些无洗涤步骤之后，直接读取Alpha计数。需要注意的是，这些检测需要配备专门的AlphaScreen微孔板读取仪。这种检测设计以其快速完成时间和高度适用于高通量应用而非常有效，例如用于筛选小分子库以发现新的PARP抑制剂。其他应用还包括准确测量化合物的EC50值。

2.2 筛选将PARP固定在DNA上的化合物 

当PARP1和PARP2结合受损的DNA时，它们会将PAR链添加到自身的蛋白骨架上（自聚腺苷二磷酸核糖基化，auto-PARylation），随后再添加到其他DNA损伤应答（DDR）蛋白上，以招募并激活它们。随后，PARylated的PARP1和PARP2从DNA上脱离，以便其他PARylated的修复伙伴能够启动修复过程。一些已获批的药物通过与NAD?竞争结合催化位点来抑制PARP1和PARP2的活性。没有NAD?时，PARP无法进行PARylation，且持续结合在受损的DNA上，阻止其他DDR蛋白接近DNA。这会阻碍DNA修复，增加细胞毒性，从而增强这些药物的作用。因此，这类药物的细胞毒性主要取决于它们将蛋白固定在受损DNA上的效率，尽管科学家最近发现，与PARP2不同，将PARP1通过PARP抑制剂固定在DNA上会增加细胞毒性。因此，筛选这些药物时应包括能够定量检测PARP固定能力的检测，并区分抑制剂对PARP1或PARP2的选择性。

大多数商业化的PARP活性检测方法仅定量检测目标蛋白（如组蛋白）的PARylation，并且一次只检测一种PARP酶。相比之下，BPS Bioscience的cat#78317能够在同一检测中比较一种分子固定PARP1与PARP2的能力。该检测使用荧光标记的DNA探针，这些探针根据PARP1或PARP2的结合发出偏振光。当PARP1或PARP2结合到DNA时，这些探针具有高荧光偏振（FP）。当科学家在检测中加入NAD?时，PARylated的酶会从探针上脱离，降低FP水平。如果他们加入NAD?和PARP抑制剂，抑制剂的固定能力会以剂量依赖的方式增加FP。

2.3 优化针对PARP1的PROTACs  (蛋白水解靶向嵌合分子) 

蛋白水解靶向嵌合分子（Proteolysis Targeting Chimeras，简称PROTACs）通过将目标蛋白靶向到泛素E3连接酶，促进蛋白酶体介导的蛋白质降解。通过PROTAC诱导的PARP降解可能是从靶细胞中消除该蛋白的替代策略。一个PROTAC分子由一个结合E3连接酶的配体组成，通过一个连接子与结合目标蛋白的配体相连。这种新技术与传统的小分子介导的蛋白质活性抑制相比具有独特的优势。例如，一个单一的PROTAC可以促进多种蛋白质的降解，因为在其靶标的降解后它可以被回收利用。它已被证明特别适用于“难以成药”的蛋白质，因为至少在理论上，任何目标蛋白都可以使用这种技术进行靶向。然而，PROTAC的开发需要经过几个优化步骤，这些步骤因蛋白质降解量化的技术难度而受到阻碍。PROTAC优化检测通过直接测量PROTAC介导的复合物形成来绕过这些困难。

2.4 筛选与Olaparib在PARP相同结合位点的化合物

PARP与含有olaparib的荧光探针结合，形成复合物。当受到偏振光激发时，该复合物由于其在溶液中的运动受限而发出高度偏振光（FP）。在测试化合物存在的情况下，PARP可能与测试化合物（如果该化合物与Olaparib具有相同的PARP结合位点）或与含有Olaparib的荧光探针形成复合物。如果测试化合物与PARP在同一位点结合，则含有olaparib的荧光探针留在溶液中并自由旋转，这表现为低FP。FP值的下降与测试化合物与PARP的竞争性结合成正比。