JPT将重叠肽段沿着目标蛋白的氨基酸序列进行排列,以实现T细胞刺激的最优化,同时尽量减少遗漏T细胞表位的可能性。您可以使用PepMix肽段混合物来替代蛋白(例如重组蛋白)或病原体裂解物,用于抗原特异性T细胞的刺激。与蛋白抗原相比,PepMix肽段混合物能够提供更有效的刺激,因为它们不需要通过抗原呈递的外源途径进行处理。PepMix肽池在全球范围内被广泛用于基础和临床研究的各种目的,例如抗原特异性T细胞的检测、计数和功能分析,增殖研究以及T细胞扩增等。
提供的细胞内细胞因子染色(ICS)和酶联免疫斑点(ELISpot)实验方案详细说明了在外周血单个核细胞(PBMCs)悬液中刺激T细胞的方法。PBMCs可以通过密度梯度离心从抗凝(最好使用肝素抗凝)的全血中新鲜制备。这些实验方案仅作为使用PepMix的示例,如果使用全血或包含其他来源T细胞的悬液,则需要对实验步骤进行调整。
PepMix肽池
一般情况下,PepMix肽池包含15个氨基酸长度的肽段,覆盖所指示蛋白的完整序列,且相邻肽段之间有11个氨基酸的重叠。每瓶含有每种肽段25微克(约15纳摩尔),足以刺激多达2.5×10?个细胞。每种肽段均为化学合成、纯化,并在加入PepMix之前通过液相色谱-质谱(LC-MS)进行分析。
酶联免疫斑点(ELISpot)和细胞内细胞因子染色(ICS)实验方案
酶联免疫斑点(ELISpot)实验:本方案是为外周血单个核细胞(PBMCs)的刺激而设计的。如果用于其他材料,可能需要进行调整。PBMCs可以从全血或白细胞层分离得到。或者,也可以使用冻存的PBMC样本。在这种情况下,设置一个让细胞恢复的静置步骤可能是有用的。
1. 向包被有捕获抗体的ELISpot板的每个孔中加入100微升含有10万到30万个细胞(1-3×10?细胞/毫升)的细胞悬液。此外,向每个孔中加入100微升刺激液(最终浓度加倍)。
2. 将板置于37℃、5% CO?的湿化培养箱中孵育至少16小时,以刺激细胞。
3. 多次洗涤板以去除附着的细胞。
4. 向孔中加入您选择的合适检测抗体,使其达到期望的浓度(例如1微克/毫升)。
5. 在湿化培养箱(37℃,5% CO?)中孵育2小时。
6. 多次洗板。
7. 如果使用生物素标记的抗体,在此步骤加入链霉亲和素偶联的酶,并在室温下于暗处孵育1小时。
8. 多次洗板。
9. 向孔中加入100微升适当的底物,等待斑点显色(通常在3-7分钟后)。
10. 用自来水冲洗孔以终止反应。
11. ELISpot板在分析前应晾干。
12. 最好使用ELISpot读板仪计数斑点。
细胞内细胞因子染色(ICS)实验:在标准的96孔圆底板中,适合用于PBMC刺激的总体积为200微升。例如,您可以在该体积中刺激20万到50万(0.2×106到0.5×106)个细胞。我们建议将细胞浓度调整为2×106个细胞/毫升,以便在100微升细胞悬液中分装20万(0.2×106)个细胞。
将细胞制备调整为2×106个细胞/毫升,使用合适的检测培养基,例如1640 RPMI培养基,其中含有2 mmol/L L-谷氨酰胺、5%(体积比)人AB型男性血清、1% MEM非必需氨基酸溶液(100倍浓缩)和1 mM丙酮酸钠溶液(100 mM)。短期刺激可能不需要添加抗生素。从PepMix储备液中在检测培养基中制备双倍浓度的PepMix溶液,并补充20 ug/ml布雷菲德菌素A(双倍工作浓度)。
1. 向无菌96孔板的每个孔中加入100微升含有20微克/毫升布雷菲德菌素A(双倍工作浓度)的肽溶液。对于未刺激对照组,将100微升含有相应量DMSO和布雷菲德菌素A的检测培养基加入孔中。每个实验条件以及阳性和阴性对照组至少准备两个重复孔(两个孔)。
**注意**:如果同时使用另一种刺激物(例如蛋白、细菌或病毒裂解物)进行平行刺激,而这些刺激物需要细胞内蛋白处理,从而需要延迟中断蛋白向高尔基体的运输以阻断细胞因子分泌,那么可以在加入肽2小时后再向细胞中加入布雷菲德菌素A。
2. 向每个孔中加入100微升含有20万个细胞的细胞悬液。
3. 盖上板盖,将板置于标准细胞培养箱(37℃,5% CO2饱和水汽环境)中进行细胞刺激。根据您的科学问题,细胞可以刺激6到16小时。
4. 刺激完成后,将板以300×g、4℃离心6分钟。小心地通过轻柔但有力地晃动板来丢弃上清液。
5. 用含有0.5%(重量/体积)牛血清白蛋白的200微升PBS重悬细胞沉淀。
6. 再次离心板,并按照步骤4所述丢弃上清液。
7. 在50微升的最终体积中进行表面染色,用于免疫表型分析,4℃黑暗中孵育20分钟。至少使用针对CD3、CD4和CD8的抗体来区分细胞毒性T淋巴细胞和T辅助细胞。这些抗体应适用于随后的固定和通透处理程序。通过抗体滴定验证必要的抗体浓度。
8. 染色后,加入含有0.5%(重量/体积)牛血清白蛋白的150微升PBS,并将板以300×g、4℃离心6分钟。小心地通过轻柔但有力地晃动板来丢弃上清液。
9. 用含有0.5%(重量/体积)牛血清白蛋白的200微升PBS重悬细胞沉淀。
10. 再次离心板,并按照步骤8所述丢弃上清液。
11. 用含有甲醇和皂甙的固定缓冲液(例如每孔50微升BD Cytofix/Cytoperm)对细胞进行通透处理,用于细胞内染色,4℃黑暗中孵育20分钟。
12. 每孔加入150微升维持细胞通透状态的洗涤缓冲液(例如BD Perm/Wash缓冲液),并将板以300×g、4℃离心6分钟。小心地通过轻柔但有力地晃动板来丢弃上清液。
13. 用200微升洗涤缓冲液重悬细胞沉淀。
14. 再次离心板,并按照步骤12所述丢弃上清液。
15. 将适合您感兴趣的细胞因子的细胞内染色抗体稀释在洗涤缓冲液中,每孔加入50微升混合液。充分混匀,但避免因缓冲液中的皂甙而产生泡沫。4℃黑暗中孵育30分钟。
16. 细胞内染色完成后,每孔加入150微升洗涤缓冲液,并将板以300×g、4℃离心6分钟。小心地丢弃上清液。
17. 用流式细胞术缓冲液(例如含有0.5%(重量/体积)牛血清白蛋白的Dulbecco改良磷酸盐缓冲液(D-PBS))重悬细胞沉淀。
18. 再次离心板,并按照步骤16所述丢弃上清液。
19. 用100微升流式细胞术缓冲液重悬细胞沉淀,并根据您的仪器进行流式细胞术检测。
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JPT作为优质肽合成专家,多肽/肽库之王,可提供丰富的PepMix肽池:
货号 | 名称 | 规格 |
PM-CEF-E-1 | CEF Pool (extended) | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEF-E-2 | CEF Pool (extended) | 120 nmol /peptide |
PM-CEF-E-3 | CEF Pool (extended) | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEF-E-4 | CEF Pool (extended) | 120 nmol /peptide |
PM-CEF-S-1 | CEF Pool (standard) | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEF-S-2 | CEF Pool (standard) | 120 nmol /peptide |
PM-CEF-S-3 | CEF Pool (standard) | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEF-S-4 | CEF Pool (standard) | 120 nmol /peptide |
PM-CEFSX-1 | CEFSX Ultra SuperStim Pool | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEFSX-2 | CEFSX Ultra SuperStim Pool | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEFT-1 | CEFT Pool | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEFT-2 | CEFT Pool | 120 nmol /peptide |
PM-CEFT-3 | CEFT Pool | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEFT-4 | CEFT Pool | 120 nmol /peptide |
PM-CEFT-MHC-II-1 | CEFT MHC-II Pool | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEFT-MHC-II-2 | CEFT MHC-II Pool | 120 nmol /peptide |
PM-CEFT-MHC-II-3 | CEFT MHC-II Pool | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEFT-MHC-II-4 | CEFT MHC-II Pool | 120 nmol /peptide |
PM-CEFX-1 | CEFX Ultra SuperStim Pool | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEFX-2 | CEFX Ultra SuperStim Pool | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEFX-3 | CEFX Ultra SuperStim Pool MHC-II Subset | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
PM-CEFX-4 | CEFX Ultra SuperStim Pool MHC-I Subset | 15 nmol (approx. 25ug) / peptide |
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