JPT：PepMix肽池

JPT将重叠肽段沿着目标蛋白的氨基酸序列进行排列，以实现T细胞刺激的最优化，同时尽量减少遗漏T细胞表位的可能性。您可以使用PepMix肽段混合物来替代蛋白（例如重组蛋白）或病原体裂解物，用于抗原特异性T细胞的刺激。与蛋白抗原相比，PepMix肽段混合物能够提供更有效的刺激，因为它们不需要通过抗原呈递的外源途径进行处理。PepMix肽池在全球范围内被广泛用于基础和临床研究的各种目的，例如抗原特异性T细胞的检测、计数和功能分析，增殖研究以及T细胞扩增等。

提供的细胞内细胞因子染色（ICS）和酶联免疫斑点（ELISpot）实验方案详细说明了在外周血单个核细胞（PBMCs）悬液中刺激T细胞的方法。PBMCs可以通过密度梯度离心从抗凝（最好使用肝素抗凝）的全血中新鲜制备。这些实验方案仅作为使用PepMix的示例，如果使用全血或包含其他来源T细胞的悬液，则需要对实验步骤进行调整。

PepMix肽池

一般情况下，PepMix肽池包含15个氨基酸长度的肽段，覆盖所指示蛋白的完整序列，且相邻肽段之间有11个氨基酸的重叠。每瓶含有每种肽段25微克（约15纳摩尔），足以刺激多达2.5×10?个细胞。每种肽段均为化学合成、纯化，并在加入PepMix之前通过液相色谱-质谱（LC-MS）进行分析。

酶联免疫斑点（ELISpot）和细胞内细胞因子染色（ICS）实验方案

酶联免疫斑点（ELISpot）实验：本方案是为外周血单个核细胞（PBMCs）的刺激而设计的。如果用于其他材料，可能需要进行调整。PBMCs可以从全血或白细胞层分离得到。或者，也可以使用冻存的PBMC样本。在这种情况下，设置一个让细胞恢复的静置步骤可能是有用的。

1. 向包被有捕获抗体的ELISpot板的每个孔中加入100微升含有10万到30万个细胞（1-3×10?细胞/毫升）的细胞悬液。此外，向每个孔中加入100微升刺激液（最终浓度加倍）。

2. 将板置于37℃、5% CO?的湿化培养箱中孵育至少16小时，以刺激细胞。

3. 多次洗涤板以去除附着的细胞。

4. 向孔中加入您选择的合适检测抗体，使其达到期望的浓度（例如1微克/毫升）。

5. 在湿化培养箱（37℃，5% CO?）中孵育2小时。

6. 多次洗板。

7. 如果使用生物素标记的抗体，在此步骤加入链霉亲和素偶联的酶，并在室温下于暗处孵育1小时。

8. 多次洗板。

9. 向孔中加入100微升适当的底物，等待斑点显色（通常在3-7分钟后）。

10. 用自来水冲洗孔以终止反应。

11. ELISpot板在分析前应晾干。

12. 最好使用ELISpot读板仪计数斑点。

细胞内细胞因子染色（ICS）实验：在标准的96孔圆底板中，适合用于PBMC刺激的总体积为200微升。例如，您可以在该体积中刺激20万到50万（0.2×10⁶到0.5×10⁶）个细胞。我们建议将细胞浓度调整为2×10⁶个细胞/毫升，以便在100微升细胞悬液中分装20万（0.2×10⁶）个细胞。

将细胞制备调整为2×10⁶个细胞/毫升，使用合适的检测培养基，例如1640 RPMI培养基，其中含有2 mmol/L L-谷氨酰胺、5%（体积比）人AB型男性血清、1% MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）和1 mM丙酮酸钠溶液（100 mM）。短期刺激可能不需要添加抗生素。从PepMix储备液中在检测培养基中制备双倍浓度的PepMix溶液，并补充20 ug/ml布雷菲德菌素A（双倍工作浓度）。

1. 向无菌96孔板的每个孔中加入100微升含有20微克/毫升布雷菲德菌素A（双倍工作浓度）的肽溶液。对于未刺激对照组，将100微升含有相应量DMSO和布雷菲德菌素A的检测培养基加入孔中。每个实验条件以及阳性和阴性对照组至少准备两个重复孔（两个孔）。  

**注意**：如果同时使用另一种刺激物（例如蛋白、细菌或病毒裂解物）进行平行刺激，而这些刺激物需要细胞内蛋白处理，从而需要延迟中断蛋白向高尔基体的运输以阻断细胞因子分泌，那么可以在加入肽2小时后再向细胞中加入布雷菲德菌素A。  

2. 向每个孔中加入100微升含有20万个细胞的细胞悬液。  

3. 盖上板盖，将板置于标准细胞培养箱（37℃，5% CO₂饱和水汽环境）中进行细胞刺激。根据您的科学问题，细胞可以刺激6到16小时。  

4. 刺激完成后，将板以300×g、4℃离心6分钟。小心地通过轻柔但有力地晃动板来丢弃上清液。  

5. 用含有0.5%（重量/体积）牛血清白蛋白的200微升PBS重悬细胞沉淀。  

6. 再次离心板，并按照步骤4所述丢弃上清液。  

7. 在50微升的最终体积中进行表面染色，用于免疫表型分析，4℃黑暗中孵育20分钟。至少使用针对CD3、CD4和CD8的抗体来区分细胞毒性T淋巴细胞和T辅助细胞。这些抗体应适用于随后的固定和通透处理程序。通过抗体滴定验证必要的抗体浓度。  

8. 染色后，加入含有0.5%（重量/体积）牛血清白蛋白的150微升PBS，并将板以300×g、4℃离心6分钟。小心地通过轻柔但有力地晃动板来丢弃上清液。  

9. 用含有0.5%（重量/体积）牛血清白蛋白的200微升PBS重悬细胞沉淀。  

10. 再次离心板，并按照步骤8所述丢弃上清液。  

11. 用含有甲醇和皂甙的固定缓冲液（例如每孔50微升BD Cytofix/Cytoperm）对细胞进行通透处理，用于细胞内染色，4℃黑暗中孵育20分钟。  

12. 每孔加入150微升维持细胞通透状态的洗涤缓冲液（例如BD Perm/Wash缓冲液），并将板以300×g、4℃离心6分钟。小心地通过轻柔但有力地晃动板来丢弃上清液。  

13. 用200微升洗涤缓冲液重悬细胞沉淀。  

14. 再次离心板，并按照步骤12所述丢弃上清液。  

15. 将适合您感兴趣的细胞因子的细胞内染色抗体稀释在洗涤缓冲液中，每孔加入50微升混合液。充分混匀，但避免因缓冲液中的皂甙而产生泡沫。4℃黑暗中孵育30分钟。  

16. 细胞内染色完成后，每孔加入150微升洗涤缓冲液，并将板以300×g、4℃离心6分钟。小心地丢弃上清液。  

17. 用流式细胞术缓冲液（例如含有0.5%（重量/体积）牛血清白蛋白的Dulbecco改良磷酸盐缓冲液（D-PBS））重悬细胞沉淀。  

18. 再次离心板，并按照步骤16所述丢弃上清液。  

19. 用100微升流式细胞术缓冲液重悬细胞沉淀，并根据您的仪器进行流式细胞术检测。

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