ELISpot与FluoroSpot：助力免疫疗法及细胞基因疗法效力评估的关键技术

ELISpot和FluoroSpot是开发免疫疗法以及细胞基因疗法过程中的理想效力检测方法。它们能够为CAR-T细胞的功能、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的活性、癌症疫苗的效力以及使用AAV或其他病毒载体的基因疗法提供关键的见解。如今，细胞和基因疗法（CGT）、先进治疗药物产品（ATMP）以及免疫疗法的开发速度比以往任何时候都要快。这些疗法通过修改患者自身的细胞，甚至引入新的基因来恢复正常功能，从而治疗从遗传性疾病到癌症的广泛疾病。美国食品药品监督管理局（FDA）针对CGT和ATMP评估的指南强调了全面免疫分析的重要性，并将细胞因子分泌检测视为评估这些疗法效力和安全性的必要工具。尽管流式细胞术能够为细胞群体及其功能提供有价值的见解，但它可能无法完全捕捉到由CGT和ATMP引发的细胞因子谱的细微差别。细胞因子分泌检测，包括ELISpot和FluoroSpot，能够填补这一空白，并在细胞水平上提供特定细胞因子分泌反应的详细图谱。

CAR-T细胞疗法

CAR-T细胞疗法：收集的免疫细胞在实验室中经过基因工程改造，引入嵌合抗原受体（CAR）基因，从而赋予它们识别癌细胞并增强其杀伤能力的特性。这些改造后的CAR-T细胞随后在培养中大量扩增，然后重新输注回患者体内。

CAR-T细胞疗法利用患者的免疫系统力量来对抗癌症。通过重新编辑患者的T细胞以靶向特定的癌症抗原，这种个性化的方法已经促成了六种不同的获得FDA批准的疗法，用于治疗像白血病和淋巴瘤这样的血液癌症，为治疗以前难以应对的癌症提供了新的策略。根据FDA的考量，细胞因子释放检测在CAR-T细胞产品的开发中至关重要，确保这些创新疗法的安全性和有效性。这种疗法不仅标志着我们在抗癌斗争中迈出了重大一步，还展示了精准医疗的潜力，能够提供更具针对性、更有效且侵入性更小的癌症疗法。

那么，CAR-T细胞的功能在开发过程中是如何进行测试的呢？体外和体内评估都很重要，以确保其对癌细胞的疗效。体外效力检测方法，如细胞毒性或“杀伤实验”、铬释放实验以及基于流式细胞术的方法，可以检测CAR-T细胞是否诱导靶细胞死亡。理想情况下，您希望测试CAR-T细胞在靶向癌细胞存在时是否通过脱颗粒和细胞因子释放而被激活，这正是ELISpot和FluoroSpot可以发挥关键作用的地方，因为它们在检测IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、IL-2或TNF-α分泌细胞方面具有极高的灵敏度。Mabtech甚至专门为这一目的开发了一种FluoroSpot试剂盒(货号FSP-013609-TD-2)：FluoroSpot Path：人类免疫疗法效力（三色），该 FluoroSpot Path 试剂盒用于通过 FluoroSpot 检测法计数分泌人 IFN-γ、颗粒酶 B 和 TNF-α 的细胞。

在体内，CAR-T细胞的治疗效果不仅通过肿瘤体积缩小、生存率和利用流式细胞术进行的表型分析来评估，还可以通过利用ELISpot和FluoroSpot的再激反应来评估。从动物模型或患者体内分离出CAR-T细胞，并用靶向癌细胞进行再刺激，以评估脱颗粒和细胞因子释放情况。这些技术共同为CAR-T细胞的功能提供了全面的图景，指导对疗法进行改进，以实现临床成功。

CAR-T细胞的功能可以用FluoroSpot来评估，方法是用表达肿瘤相关抗原（TAA）的癌细胞或TAA本身直接刺激细胞。功能细胞将分泌感兴趣的分析物（IFN- γ、颗粒酶B、穿孔素、IL-2或TNF-α），这些分析物可以用FluoroSpot检测到。一旦CAR-T细胞被认为具有功能，就该在临床试验环境中评估它们的疗效了。输注后，可以通过PBMC样本收集CAR-T细胞，再次通过与靶细胞共培养进行ELISpot或FluoroSpot评估其功能。这将表明将CAR-T细胞输注到患者或动物模型中是否会影响其功能。此外，监测不良反应对于评估治疗的安全性和耐受性至关重要。在这里，细胞因子风暴可能是一种不良事件，可以通过使用标准化的ELISA试剂盒检测患者或动物血清中的IL-6水平轻松评估。此外，治疗应无热原，并且可以使用几种 单核细胞活化反应测定法（MAT）（IL-6 ELISA、IL-1b ELISA和IL-6/IL-1b FluoroSpot）进行评估。除了CAR-T细胞疗法外，TCR（T细胞受体）疗法作为一种能够以更高特异性靶向更广泛癌症抗原的强大方法正在兴起。这些疗法改造患者的T细胞以表达针对癌症抗原的特定TCR，从而增强其抗击癌症的能力。此外，CAR-NK疗法（即经过改造的自然杀伤细胞）也逐渐受到关注，因为它们能够在无需预先致敏的情况下靶向肿瘤，可能降低细胞因子释放综合征的风险。TCR和CAR-NK疗法都可以使用与CAR-T细胞相似的体外和体内方法进行评估，以确保其疗效和安全性得到充分评估。

肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）

肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）:TILs是直接从患者的肿瘤组织中获取的。从提取的肿瘤中分离出来后，培养TILs以显著增加其数量，然后重新引入患者体内。

在细胞免疫疗法的个性化基础上，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）为癌症治疗提供了另一片新天地。这些直接从患者肿瘤中分离出来的细胞，天生擅长识别癌细胞，这意味着它们不需要像CAR-T细胞那样的基因工程改造。然而，与CAR-T细胞一样，它们也会被扩增到数百万，并重新输注以增强对肿瘤的免疫反应。鉴于FDA对全面免疫反应评估的重视，像ELISpot和FluoroSpot这样的细胞因子分泌检测方法非常适合用于检测分离出的TILs的功能性、活性和效力。

那么，ELISpot或FluoroSpot如何用于监测TILs在生产过程中的效力呢？TIL研究人员在评估TILs效力时，主要想解答三个问题。首先，分离出的TILs是否能够被激活以对抗自体肿瘤。在这里，培养的TILs会暴露于癌细胞中，并通过ELISpot或与FluoroSpot（IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、IL-2或TNF-α）多重检测来捕获能够杀死靶细胞的相关细胞因子和分析物，从而检测它们的反应。Mabtech开发了一种非常适合评估TIL产品的FluoroSpot试剂盒(货号FSP-013609-TD-2)：FluoroSpot Path：人类免疫疗法效力（3色）。其次，需要评估TILs在快速扩增（REP）或大规模培养过程后的组成变化。来自这两种生产策略的细胞会用肿瘤相关肽刺激，并通过ELISpot或FluoroSpot评估它们的反应性分泌特征。最后，与CAR-T细胞一样，使用MAT检测策略（IL-6 ELISA、IL-1b ELISA、IL-6/IL-1b FluoroSpot）进行热原检测也是必不可少的。

TILs的功能可以通过FluoroSpot进行评估，方法是直接用表达肿瘤特异性抗原（TSA）的自体癌细胞或TSA肽池来刺激这些细胞。功能正常的细胞会分泌感兴趣的分析物（IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、IL-2或TNF-α），这些分析物可以用FluoroSpot检测到。

癌症疫苗

癌症疫苗：研究人员收集测序数据以识别潜在的肿瘤特异性抗原（TSAs），这些抗原随后被用于制造病毒载体、肽或DNA/RNA基础的疫苗，并将这些疫苗提供给患者以引发针对癌症的特异性免疫反应。

癌症疫苗旨在激发针对肿瘤的强烈免疫反应，并为新型癌症治疗铺平了道路。这些疫苗有多种形式：核酸疫苗，利用DNA或RNA，指示患者的细胞产生肿瘤抗原，从而引发针对性的免疫反应；细胞疫苗引导免疫反应针对癌细胞抗原；病毒疫苗利用改造后的病毒递送癌症抗原；肽疫苗利用癌细胞中的短蛋白序列来刺激免疫反应。

我们之前在其他疗法中提到过肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs）作为潜在靶点，癌症疫苗也不例外。然而，由于TSAs具有更高的免疫原性，并且它们不存在于健康组织中，从而避免了不必要的组织损伤，因此出现了向TSAs转变的趋势。这些癌症疫苗标志着一种多维度刺激人体防御机制的方法，开启了抗击癌症的新纪元。每种疫苗类型在开发和评估过程中都有其独特的挑战，其中像ELISpot和FluoroSpot检测这样的敏感工具在评估它们的疗效和塑造其治疗潜力方面具有不可估量的价值。通过ELISpot和FluoroSpot检测，可以简化对患者体内强大且具有癌症特异性的免疫反应的评估。在疫苗接种前以及接种后（包括加强针）收集的PBMC样本可以直接进行分析，或者在分选为CD8或CD4 T细胞亚群后再进行分析。当这些细胞受到TSA衍生肽池的刺激时，它们会通过分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、颗粒酶B和穿孔素来揭示关键的免疫反应，而这些反应可以通过这些检测方法轻松测量。为什么不试试Mabtech专门设计用于评估与疫苗诱导反应相关的重要的分析物分泌的FluoroSpot Path：人类免疫监测（3色）试剂盒(货号FSP-010209-TD-2)呢？

可以用TSA衍生的肽池刺激分离的pbmc，以测量癌症疫苗诱导的癌症特异性T细胞反应。

利用病毒载体进行基因治疗

利用病毒载体进行基因治疗：基于病毒载体的基因治疗首先设计一个包含缺失或缺陷基因的转基因质粒。然后制备包含转基因的病毒载体，并将其给予患者以恢复特定蛋白质的产生和正常功能。

基因疗法是用于对抗遗传性或复杂疾病的创新策略。其目标是通过基因校正、基因替换或增强，或基因沉默来替换突变或缺失的基因。这里我们将重点介绍体内疗法，即通过病毒载体将感兴趣的基因传递给患者。腺相关病毒（AAV）基因疗法是目前最常用的病毒载体基因疗法。这些疗法利用经过改造的非致病性AAV载体，因其靶向精准和稳定的基因传递而受到青睐。AAV基因疗法引入功能性基因（称为转基因），以补偿有缺陷或缺失的基因，从而有望从根本上纠正疾病。目前已有几种获得FDA批准的AAV疗法，它们在遗传医学领域树立了先例，为治愈曾经被认为是终生挑战的遗传性疾病打开了大门。免疫反应评估的作用变得越来越重要，而ELISpot和FluoroSpot检测为了解免疫系统与这些新型治疗药物的相互作用提供了关键策略。传统上，对AAV基因疗法的免疫反应检测主要集中在通过IgG ELISA试剂盒或中和试验检测针对AAV或转基因蛋白的特异性抗体。然而，评估T细胞介导的免疫反应同样重要，并且可以提供额外的重要免疫见解。通过使用来自AAV载体和转基因的肽池分析治疗前后的PBMC样本，ELISpot和FluoroSpot检测可以对细胞免疫反应进行敏感且稳健的评估。理想情况下，对于成功的疗法，人们希望在针对IFN-γ、TNF-α、IL-2和颗粒酶B的检测中，几乎或根本没有斑点形成。此外，还可以定量检测先天免疫反应，如I型干扰素分泌（IFN-α或IFN-β），从而提供免疫系统与疗法相互作用的全面概况。

在AAV基因治疗之前和之后可以分离免疫细胞，使用AAV或转基因衍生的肽池来评估它们的免疫原性。此外，还会测试对AAV和转基因本身的先天反应，特别是浆细胞样树突状细胞（pDCs）和其他I型干扰素反应的先天驱动因素。

检查点阻断抑制剂

检查点抑制剂是一种免疫疗法，通过阻断抑制免疫系统有效攻击癌细胞的蛋白发挥作用。这些疗法通常被归类为单克隆抗体和靶向治疗，因为它们可以直接靶向特定的免疫检查点，如PD-1或CTLA-4，这些检查点负责抑制免疫反应。ELISpot和FluoroSpot检测是评估检查点抑制剂疗效的关键工具。通过检测细胞因子分泌，如IFN-γ或TNF-α，这些检测可以直接证明T细胞在检查点阻断疗法下的活性增强。FluoroSpot能够同时检测多种细胞因子，可以进一步表征由检查点抑制剂激活的T细胞的多功能性，从而更全面地理解免疫反应。这种免疫监测对于在临床前和临床环境中评估检查点抑制剂的效力和作用机制至关重要。

希望通过以上内容能够展示ELISpot和FluoroSpot在不同细胞与基因治疗（CGTs）的开发和评估中不可或缺的作用。这些检测可以提供深入的免疫反应数据，对于推进临床试验和促进新兴疗法的成功至关重要。

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