细胞核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒化验程序说明

细胞核和细胞质蛋白质的提取不仅可以用于研究细胞内蛋白质的定位，而且在许多情况下也是如此。提取蛋白可用于转录调控的研究，如Western印迹、电泳迁移率转移测定（EMSA）、足迹分析、转录测定，或作为纯化调控蛋白的起点。细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒能够从哺乳动物培养的细胞或组织中逐步分离和制备粗细胞质和细胞核提取物。该试剂盒的基础是允许细胞在低渗缓冲液中膨胀。然后细胞被破坏，细胞质部分被去除，核蛋白通过高盐缓冲液从细胞核中释放出来。未变性的活性蛋白质在不到两小时的时间内被纯化

艾美捷细胞核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒：

Cat #: D-AKE3001

Size: 50T

Storage: Stored at -20°C for 12 months

供应材料和储存条件：

试剂准备

工作细胞质溶液A（工作CESA）：使用前，将10μL蛋白酶抑制剂（100×）和2μL DTT（500×）加入1mL CESA中，置于冰上，在4℃下储存。

细胞质溶液B（CESB）：供应即用。使用前放在冰上，4℃保存。

工作核提取溶液（工作NES）：使用前，将10μL蛋白酶抑制剂（100×）和2μL DTT（500×）添加到1 mL NES中，置于冰上，在4°C下储存。

DTT（500×）：随附随用。使用前放在冰上；储存温度为-20°C。剩余的工作解决方案可以是

等分后保存于-20℃，避免重复冻融。

蛋白酶抑制剂（100×）：随附即用。使用前放在冰上；储存在-20°C。剩余工作

溶液等分后可在-20°C下储存，以避免重复冷冻和解冻。

细胞核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒化验程序：

注：在2-8°C温度下执行所有步骤。使用预冷缓冲器和设备。确保所有溶液均已解冻且均匀。

I-A细胞培养制剂

1.对于粘附细胞，收获2×10? 用细胞刮刀对细胞进行刮除，然后在500 g离心5分钟。对于悬浮细胞，通过在500 g下离心5分钟来收获。

2.通过用冷PBS悬浮细胞颗粒来洗涤细胞。以500g离心2-3分钟，并丢弃PBS。

注意：使用移液管小心取出并丢弃PBS，使细胞颗粒尽可能干燥。

3.向细胞沉淀中加入200μl冷加工CESA。进行程序Ⅲ。

1-B组织制备

1.将30-60毫克的组织切成小块，放入离心管中。

2.用PBS清洗纸巾。将组织以500g离心5分钟，并丢弃PBS。

注意：使用移液管小心取出并丢弃PBS，使样品尽可能干燥。

3.将组织在200μl冷的CESA中轻轻复苏。

4.使用Dounce匀浆器匀浆组织，直到90%以上的细胞破碎，并在显微镜下观察细胞核。继续步骤III。

ll细胞质和细胞核蛋白质提取：

1.在最高设置下剧烈涡旋试管15 s，以完全悬浮细胞颗粒。将试管在冰上培养15分钟，使细胞膨胀。

2.向试管中加入10μL冷的CESB。在最高设置下使管子涡旋10-15秒。将试管在冰上培养1-2

最小。

3.将试管在4℃下以16000 g离心5分钟。

4.立即将上清液（细胞质提取物）转移到干净的冷管中。将此试管放置在冰上直到使用，或在-80°C下保存更长时间。颗粒（含有核）通常是粘性的，并且不是很紧密。

可选：为了去除细胞核中残留的细胞质蛋白，用额外的coldWorking CESA缓冲液或PBS冲洗颗粒。然后重复步骤3和4中的步骤lll 1-2次。

5.加入100μL预冷的工作NES，重新悬浮颗粒。将样品放在冰上，每10分钟继续涡旋15秒，持续30分钟。避免形成泡沫。

6.在4℃下以16000 g离心15分钟。

7.将上清液（核蛋白）加入冷离心管中，取出小份进行蛋白质定量检测。将其他含有核蛋白的离心管储存在-80°C。避免反复结冰和滑行。

注：根据方案提取的核蛋白悬浮在高盐缓冲液NES中。如果在随后的应用中需要大量的核提取物，或者如果下游分析出现问题，则在使用前对核提取物进行透析以去除多余的盐。

Biogradetech全球生命科学和医药研发行业关键原料与试剂的领先供应商：Biogradetech成立于2015年，总部位于美国加利福尼亚州，早期以产品技术研发服务起家，逐步发展了广泛的产品线，并将其商业化销售，包括蛋白质、抗体、酶、培养基、试剂盒和仪器。适用于细胞生物学、蛋白质组学、分子生物学、免疫学、微生物学、诊断学、生物化学、神经科学、血液分析和高通量药物筛选等领域。