强大的基因组编辑工具——Crisp/cas9

      关于Crisp/cas9，这个是目前研究的一个大热门，相关的文章和技术解析层出不穷，大家对什么是Crisp/cas9应该也有了一定的了解，今天就跟大家简单的介绍一下相关的产品吧。不过首先，我们还是再过一遍Crisp/cas9的相关概念吧。

       一、 相关概念

    （1）CRISPR/Cas是什么？CRISPR是细菌中成簇存在的具有规律间隔的短回文重复序列，是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。cas 的全称是CRISPR associated protein，它是一种通过crRNA引导的DNA内切酶，如果DNA底物与引导RNA互补，Cas就会裂解入侵的外源DNA。

    （2）CRISPR和Cas9共同组成了一套系统 ，CRISPR识别外源入侵的DNA，cas9负责剪切。是细菌或者古细菌的天然防御系统。而现今，被人类利用进行基因组编辑、转录扰乱、基因敲除、表观遗传调控等。

    （3）CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中具有相似甚至更高的效率。

图1来源https://www.jianshu.com/p/1e7bff7d5830

       二 、作用机理

      II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。 这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域PAM（5’-NGG-3’）为Cas9识别位点，是实现剪切功能的关键。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA) 足以引导Cas9 对DNA的定点切割。

图2 CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理图

      通过介绍，我们了解了Crisp/cas9发挥切割作用的是cas9，起识别作用的是融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA。因此，要想做好Crisp/cas9这个实验，我们必须要准备的试剂必须涉及sgRNA和cas9蛋白两大方面。

       三、 产品推荐

      针对sgRNA和cas9，我们有如下产品可供选择哦：

      1.sgRNA系列。

     （1）sgRNA载体类型

      *配合单独表达Cas9 核酸酶(Cat.No.  CP-C9NU-01,  CP-LvC9NU-01, CP-LvC9NU-02, CP-LvC9NU-08,  CP-LvC9NU-09,  CP-LvC9NU-10)或 Cas9 D10A切口酶(Cat.No.CP-C9NI-01,  CP-C9NI-02) 的 Cas9克隆使用。

      还有有上述货号对应搭配使用的sgRNA乱序对照哦

     （2）还有sgRNA乱序对照慢病毒颗粒

      图3. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T细胞中的HUWEI基因。（A）HUWEI-sgRNA与基因组PCR引物设计；（B）在6孔板中，HUWEI-sgRNA/Cas9克隆与sgRNA/Cas9对照克隆（泳道2）转染HEK293T细胞。转染40h后收集细胞，提取基因组DNA并用HUWE特异的PCR引物进行PCR扩增，凝胶纯化PCR产物，将纯化后的产物与缓冲液混匀，经变性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI经PCR后的产物片段长度应为520bp，T7 ENI剪切后的产物应分别为330bp和190bp。

      图4. CRISPR-Cas9多重靶向编辑多个基因。实验组（1-4泳道）为Cas9表达克隆及分别表达靶向p53, HUWE1, NCL3 和 GFP基因的sgRNA克隆质粒共转染HEK293t GFP稳转细胞。对照组（5-8泳道）为Cas9表达克隆质及随机sgRNA表达克隆的质粒共转染HEK293t GFP稳转细胞。通过T7核酸内切酶检测分析基因组DNA各个靶点上同时存在的插入缺失。*号标记的条带显示Cas9核酸酶及分别靶向多个靶点的sgRNA都在目标靶点上有效地诱发了插入缺失突变（1-4道）。PCR产物条带及T7核酸内切酶酶切产物条带大小：GFP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切).

     （3）sgRNA 文库

      图5. A：混合文库筛选。对感染了sgRNA混合文库的细胞株进行筛选，获取具备目的表型的阳性细胞株进行Sanger测序识别对应的sgRNA，或通过深度测序搜索比例过高或过低的sgRNA。B：使用 sgRNAs 文库array（独立克隆文库）进行基因敲除筛选。各板孔里的细胞株分别感染不同的sgRNA慢病毒颗粒，并筛选具备目的表型的阳性细胞株。如此无需测序即可获知与目的表型相关的sgRNA。

      人类 sgRNA 文库相关产品

       2.Cas9系列产品

      （1）Cas9表达克隆产品

    （2）慢病毒颗粒类产品

     （3）GeneHero™ Cas9 稳定表达细胞系

     （4）GeneHero™ Cas9蛋白类产品

      图6. 使用HUWE DNA片段作为切割模板。针对HUWE基因设计3个sgRNA，分别与Cas9蛋白孵育后进行下一步切割实验。红点标注为切割后的DNA条带，Ct为未切割的HUWE DNA片段

      图7. 使用HUWE DNA片段作为切割模板。sgRNA与Cas9蛋白孵育后进行切割实验。GeneHero™ Cas9蛋白（3-5列）与IDT Alt-R® Cas9蛋白（6-7列）分别进行250ng，100ng和50ng稀释反应。红箭头标注为切割后的DNA条带，1列反应中只有Cas9，2列反应中只有sgRNA。

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