超高灵敏度和特异性miRNA定量方法——双尾RT-qPCR

发布者:艾美捷科技发布时间:2021-04-07

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前情回顾:miRNA绝对定量的唯一方法——miREIA


越来越多的研究表明,miRNA是许多人类病理学中有潜力的诊断和预后生物标志物,但如果准确对miRNA进行定量检测一直是个难题。


上一期我们讲到过miRNA的免疫定量的方法——miREIA,我们传统的miRNA定量的试剂盒都是基于PCR法的,有没有基于PCR法的miRNA检测试剂盒了,肯定是有的,今天小艾给大家带来了升级版的基于PCR法的miRNA定量检测试剂盒——双尾RT-qPCR。


传统microRNA PCR检测方法的痛点:用传统的PCR法检测microRNA的挑战在于,两个常规PCR引物的总长度几乎是microRNA长度的两倍,因此不适合于做miRNA的引物。以前的技术通过使用发夹引物延伸microRNA,添加poly A尾巴或通过连接添加片段来解决这个问题,但是这会降低检测的灵敏度和特异性。此外,这些方法无法检测在3'末端修饰的microRNA,因为它会干扰延伸过程。


microRNA PCR检测


市面上常见的miRNA定量检测试剂盒原理


BioVendor专利产品——双尾RT-qPCR


我们专利的双尾RT-qPCR技术,具有独特的RT引物机制,与其他方法相比,可提供出色的灵敏度和特异性。双尾RT-qPCR技术已被开发用于总的miRNA和piRNA的定量。


双尾RT-qPCR原理:与使用单个结合探针不同,双尾PCR使用两个半探针,它们分别结合到不同的microRNA片段上,这些片段通过折叠的系链连接。虽然每个半探针本身都很短, 无法结合到microRNA上,但当两个半探针互补时,它们会协同结合,这种结合的特异性是非常高的,因为在短半探针中错配的影响非常大。然后可以使用两个特定序列引物对形成的cDNA进行PCR扩增,用SYBR进行检测。


双尾RT-qPCR原理


双尾RT-qPCR优势:


高灵敏度(最多少于10个分子)

高特异性

适合于多种样本(血浆/血清,血液,组织等)中的miRNA检测和定量

通过折叠的系链连接的两个半探针(结合不同的microRNA片段)

动态范围广(高达9 log)

在进行单重qPCR之前,可进行双管多重RT-PCR

提供定制化服务


1.高灵敏度及特异性:


5?互补片段显著提高分析的灵敏度


5?互补片段显著提高分析的灵敏度


5? 互补片段显著提高检测的特异性


5? 互补片段显著提高检测的特异性


5′-hemiprobe的特异性及灵敏度验证:为了测试5′-hemiprobe对特异性的贡献,我们比较了两种双尾RT引物区分Let-7 miRNA家族的两个成员:Let-7a和Let-7f的能力,它们仅有位于miRNA序列中心的单个核苷酸的差异。RT 1引物的5'-hemiprobe设计成与let-7a的5'-末端的前十个核苷酸结合, 而RT 2引物的5'-hemiprobe结合在let-7a的8个核苷酸上,通过这种设计,区分let-7a和let-7f的核苷酸只是由RT 2引物的5′-hemiprobe检测的,而不是由RT 1引物检测的。RT 2引物的5′-hemiprobe也很短(8个核苷酸),因为我们认为探针序列较短时错配的影响会更加明显。其余的RT 1和RT 2引物序列以及所用的PCR引物是完全相同的。使用RT 2引物时,完全匹配和错配的模板之间的ΔCq(ΔCq= 11.07)显著大于使用RT 1引物(ΔCq = 4.66),不带有5′-hemiprobe的不同碱基重叠的RT 2引物,而不是不带有RT 1引物的RT 2引物。这证明了5'-半探针对系统特异性的重大贡献。值得注意的是,两种双尾RT引物完全互补的let-7a microRNA的Cq值相等,表明即使5′-hemiprobe的长度有两个碱基的不同,检测灵敏度仍然相同。


2.适用样本类型丰富:


5′-hemiprobe

5′-hemiprobe

血浆/ 血清/ 尿液/ 脑脊液/ 生物液体新鲜组织,冷冻/福尔马林固定组织的

5′-hemiprobe

细胞,外泌体

3.检测流程简便:

5′-hemiprobe 检测流程


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